成骨細胞骨形成機制研究

1　成骨細胞的起源

成骨細胞起源于多能的骨髓基質(zhì)的間質(zhì)細胞，除成骨細胞外，基質(zhì)細胞還可分化成軟骨細胞，成纖維細胞，脂肪細胞或肌細胞。成骨細胞來源譜系有以下幾種：

(1)骨髓克隆形成單位(成纖維細胞集落形成單位，CFU-F)；(2)骨祖細胞，可分化成前成骨細胞和前軟骨細胞譜系，常位于骨髓腔中，有很強的自身增殖能力；(3)前成骨細胞，即最近的成骨前體，能定向分化成成骨細胞，具有合成和增殖能力［1，2］。成骨細胞由多能的間質(zhì)干細胞在體內(nèi)的各種調(diào)控因素的調(diào)節(jié)下發(fā)展而來，調(diào)控因素主要有BMP-2，BMP-2能誘導(dǎo)基質(zhì)細胞向成骨細胞分化，具體就是誘導(dǎo)間質(zhì)干細胞分化形成骨祖細胞進而形成前成骨細胞［3］。

2　成骨細胞發(fā)展階段及骨形成機制

成骨細胞在骨形成過程中要經(jīng)歷成骨細胞增殖，細胞外基質(zhì)成熟、細胞外基質(zhì)礦化和成骨細胞凋亡四個階段。很多因素可調(diào)節(jié)這幾個階段，從而最終調(diào)控骨形成。

成骨細胞增殖期成骨細胞數(shù)量增加，以形成多層細胞，并合成、分泌Ⅰ型膠原以便最終可以礦化形成骨結(jié)節(jié)。對成骨細胞增殖的調(diào)控具體說來即是對細胞周期的調(diào)控，后者包括細胞在有絲分裂原作用下復(fù)制DNA和細胞分裂的調(diào)節(jié)機制，典型的成骨細胞細胞周期時間為20～24小時［4］。抑制與細胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)的基因會導(dǎo)致增殖的停止。與增殖激活有關(guān)的基因有c-myc、c-fos、c-jun；與細胞周期有關(guān)的基因有組蛋白、細胞周期素基因。在顱蓋骨分骨細胞培養(yǎng)中觀察到細胞從顱蓋骨中分離后很快即出現(xiàn)最高水平的c-fos mRNA表達，比c-myc和H4組蛋白基因表達早許多。c-myc mRNA常在1天后表達達到高峰，H4組蛋白基因表達伴隨細胞內(nèi)DNA合成，與增殖密切相關(guān)［5］。c-fos、c-jun基因表達在增殖晚期明顯下調(diào)，同時伴隨成骨細胞增殖減慢，細胞由增殖期進入分化期。c-fos對成骨細胞增殖的作用在體內(nèi)實驗中也得到證實，如在人的長骨與胚胎骨生長旺盛的區(qū)域c-fos原癌基因高表達。另有報道，c-fos高表達的小鼠中骨形成也會增加，這些均證明c-fos與成骨細胞增殖有關(guān)。而且c-fos與c-jun編碼的蛋白質(zhì)c-fos,C-jun能形成異二聚體，作為轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到基因啟動子區(qū)的AP-1位點，已觀察到在增殖的成骨細胞中有很高的AP-1結(jié)合活性，而在增殖下調(diào)后，這種高活性也明顯改變，這說明原癌基因可能通過c-fos/c-jun復(fù)合物來調(diào)節(jié)細胞增殖［2］。在成骨細胞增殖期，同時還能表達的基因有表皮生長因子(FGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ)、Ⅰ型膠原、纖維連接素(fibronectin)等基因［6］。

在細胞增殖晚期，與細胞周期與細胞增殖相關(guān)的基因表達下降，而編碼細胞外基質(zhì)成熟的蛋白的基因開始表達，在分化早期主要是堿性磷酸酶表達，因此堿性磷酸酶被認為是細胞外基質(zhì)成熟的早期標志，AKP mRNA表達此時可增加10倍以上。有學者用羥基脲抑制成骨細胞增殖，加入羥基脲1小時后觀察到DNA合成和H4組蛋白mRNA下降90%，與此同時，AKP mRNA增加4倍，證明增殖下調(diào)可提前誘導(dǎo)AKPmRNA表達［5，7］。成骨細胞分泌AKP和鈣鹽結(jié)晶體至細胞外基質(zhì)中，AKP使局部磷酸含量增高，促使基質(zhì)礦化。在細胞外基質(zhì)成熟期，膠原繼續(xù)合成并相互交聯(lián)、成熟。

在成骨細胞分化晚期，當培養(yǎng)細胞進入礦化期，細胞內(nèi)的AKP活性下降，而與細胞外基質(zhì)中羥磷灰石沉積相關(guān)的基因表達達到高峰，如骨橋蛋白(osteopontin)、骨鈣素、骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein)基因。骨鈣素等非膠原蛋白分泌至細胞外基質(zhì)中，與鈣、磷結(jié)合，然后，沿膠原分子的長軸，鈣和磷結(jié)合到膠原分子的側(cè)鏈的膠原氨基酸殘基上，形成羥磷灰石結(jié)晶。在用羥基脲抑制增殖的實驗中同時可觀察到，與AKP不同，骨鈣素，骨橋蛋白的mRNA表達不因增殖抑制而增加，證明它們與增殖無關(guān)而可能與礦化基質(zhì)中成骨細胞分化有關(guān)。Owen在體外實驗中進一步觀察β-磷酸甘油(β-GP)對骨鈣素產(chǎn)生的影響，β-GP是羥磷灰石形成的原料，能被AKP迅速水解，釋放出無機磷。如果培養(yǎng)中沒有β-GP時，即使細胞通過細胞外基質(zhì)成熟期進入礦化階段，骨鈣素基因也不能表達，說明在沒有礦物質(zhì)沉積時不能表達礦化階段的基因［5］。

體外培養(yǎng)的成骨細胞在骨礦化期骨鈣素高度增加，此后，骨鈣素逐漸降低，與此同時，可觀察到膠原酶增加，成骨細胞開始凋亡，并出現(xiàn)代償性細胞增殖和膠原合成［8］。

3　成骨細胞性骨形成的調(diào)控機制

成骨細胞在產(chǎn)生、發(fā)展的各個階段均需借助于精細的調(diào)控，以最終完成正常的骨形成。已知很多全身激素和骨組織局部調(diào)節(jié)因子都對成骨細胞發(fā)揮作用并影響成骨細胞發(fā)展的各個階段，調(diào)節(jié)成骨細胞功能。已知的全身激素如甲狀旁腺激素(PTH)、甲狀旁腺激素相關(guān)肽(PTHrp)、1，25-二羥維生素D3［1，25(OH)2D3］、降鈣素(CT)、糖皮質(zhì)激素、生長激素、甲狀腺激素、性激素等對骨形成均有影響。而近年來，骨組織局部調(diào)節(jié)因子對骨形成所起的作用尤受重視。

3.1　胰島素樣生長因子(IGFs)

IGFs是骨細胞中含量最豐富的生長因子，對成骨細胞功能起重要的調(diào)節(jié)作用，目前已知的IGF主要為IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ，IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ由骨細胞生成并儲存于骨中，在骨吸收時從骨中釋放出來；成骨細胞在骨吸收時也能分泌增加量的IGFs，以自分泌方式發(fā)揮作用，刺激成骨細胞增殖和分化；另外由破骨細胞產(chǎn)生的IGFs以旁分泌方式作用于成骨細胞。因為IGF對骨形成有很強的促進作用，因此IGFs在骨吸收時大量增加介導(dǎo)了骨吸收和骨形成之間的偶聯(lián)作用，使骨吸收后骨形成增加［9］，有利于骨重建的正常進行。IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ?qū)Τ晒羌毎淖饔没鞠嗨?，但IGF-Ⅱ作用較IGF-Ⅰ弱。IGF-Ⅰ、Ⅱ在成骨細胞培養(yǎng)中均可刺激成骨細胞的增殖和Ⅰ型膠原的生成，且與劑量有相關(guān)性，同時IGFs還可刺激堿性磷酸酶活性以及骨鈣素的產(chǎn)生［10］。離體實驗顯示IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ促進鼠成骨細胞原癌基因c-fos的表達，后者可能在誘導(dǎo)成骨細胞增殖中起重要作用。不僅如此，IGFs還能介導(dǎo)全身激素如糖皮質(zhì)激素、PTH、1，25(OH)2D3、雌激素及機械壓力對成骨細胞增殖和分化的作用。另外IGFs與其他生長因子產(chǎn)生協(xié)同作用，共同刺激成骨細胞增殖和分化。骨組織中IGF受其自身合成，IGF受體數(shù)目及其親和力、IGFBPs等調(diào)節(jié)［9，11］。TGFβ也能調(diào)節(jié)IGF-Ⅰ表達，TGFβ增加人成骨細胞IGF-Ⅰ表達，而抑制鼠成骨細胞的IGF-Ⅰ表達。

IGFs為小蛋白，在血循環(huán)中半衰期很短，IGFs在體內(nèi)與胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(IGFBPs)結(jié)合后半衰期延長很多。骨組織中共存在6種結(jié)構(gòu)相關(guān)的IGFBPs，IGFBPs可調(diào)節(jié)IGF作用。骨中IGFBP1-6除IGFBP-1外，其余均由成骨細胞產(chǎn)生，IGFBP-3、IGFBP-5可促進IGF對成骨細胞的刺激作用。而其他IGFBPs尤其是IGFBP-4阻止IGFs結(jié)合到胰島素樣生長因子受體(IGFR)上，抑制IGF活性。很多因素可調(diào)節(jié)IGFBPs產(chǎn)生，從而影響骨形成。骨細胞中，IGFs能調(diào)節(jié)IGFBps水平，使IGFBP-4減少而IGFBP-5增加。TGFβ減少IGFBP-4mRNA表達，同時顯著增加IGFBP-4蛋白分解。在SaOS-2細胞系中，PTH增強IGFBP-4的結(jié)合活性及抑制IGFBP-4蛋白酶活性，從而對成骨細胞產(chǎn)生抑制作用，而雌二醇可以消除PTH的這些作用。此外，皮質(zhì)激素能抑制IGFBP-5表達而1，25(OH)2D3刺激IGFBP-4表達從而二者均抑制成骨細胞增殖［9，12］。

3.2　轉(zhuǎn)化生長因子(TGFβ)

TGFβ超家族包括TGFβs，骨形態(tài)蛋白2-7(BMPs2-7)，肌動蛋白(actin)，抑制素(inhibitin)。TGFβ合成初期是一種無活性的大分子復(fù)合物。骨基質(zhì)中有大量的無活性TGFβ，當pH降低或纖溶酶及組織蛋白酶激活時，可使無活性的TGFβ活化。骨組織中骨吸收區(qū)pH值較低，可使TGFβ活化，因為TGFβ對成骨細胞骨形成產(chǎn)生重要影響，因此TGFβ可以調(diào)節(jié)骨吸收區(qū)新骨的形成。TGFβ對骨形成作用很復(fù)雜。在體外培養(yǎng)中TGFβ可以抑制或刺激成骨細胞增殖。這些矛盾的結(jié)果部分由于各個實驗中所使用的TGFβ濃度，細胞密度，細胞來源不同［13］。TGFβ刺激非轉(zhuǎn)化的成骨細胞DNA合成及細胞增殖，同時，TGFβ誘導(dǎo)c-fos原癌基因表達，而用c-fos反義mRNA能阻斷TGFβ的致有絲分裂作用，證明c-fos表達在TGFβ誘導(dǎo)的成骨細胞增殖中有重要意義。目前，對TGFβ對成骨細胞分化功能的影響存在不同的結(jié)論，有報道，在原代成骨細胞培養(yǎng)中，TGFβ抑制AKP和骨鈣素的合成。但另有學者報道，TGFβ可以明顯促進細胞外基質(zhì)的合成，刺激膠原、骨連接素(osteonectin)和骨橋蛋白合成，增加骨基質(zhì)沉積率［14］。另外，TGFβ1減少膠原酶轉(zhuǎn)錄并加速膠原酶mRNA降解，這有利于維持骨中的膠原基質(zhì)。在體實驗中，實驗動物接受TGFβ2系統(tǒng)性治療能使其小梁骨的形成增加，并且在鼠股骨骨膜下注射TGFβ1和TGFβ2也能促使骨發(fā)生［15］。這些均證明TGFβ對骨形成起重要作用。TGFβ在人骨中的量隨年齡增加而下降。體外研究中發(fā)現(xiàn)1，25(OH)2D3、E2可以增加鼠成骨細胞TGFβ產(chǎn)量。1，25(OH)2D3并能調(diào)節(jié)TGFβ受體表達。在人成骨細胞中，睪酮和PTH同樣能增加TGFβ產(chǎn)量，除此之外，BMP-2也能增加TGFβ表達，而且TGFβ可自身誘導(dǎo)TGFβ表達［9］。

3.3　骨形態(tài)蛋白(BMPs)

BMPs是TGFβ超家族成員，具有刺激成骨的作用。BMP可由成骨細胞產(chǎn)生，產(chǎn)生的BMP主要與骨基質(zhì)結(jié)合，很少釋放到骨外。BMP的主要生物學作用是誘導(dǎo)未分化的間質(zhì)細胞分化形成軟骨和新生骨，前面已提到，BMP-2誘導(dǎo)成骨細胞的前體細胞分化成成骨細胞。在MC3T3-E1小鼠成骨樣細胞培養(yǎng)中，BMP能增加AKP活性和膠原合成，但對成骨細胞增殖不起作用［2］。在鼠骨肉瘤ROS17/2.8細胞系培養(yǎng)中，BMP-7抑制細胞增殖，而在人成骨細胞培養(yǎng)中，BMP-7刺激細胞增殖。BMPs與其他生長因子相互作用，共同誘導(dǎo)新骨形成，如TGFβ、VitD可使BMP-2增加。糖皮質(zhì)激素促進BMP-2、BMP-4對成骨細胞分化的誘導(dǎo)作用并在分化早期促進BMP-6合成，BMP-6在成骨細胞分化早期有重要作用，它介導(dǎo)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的成骨細胞分化。BMPs對其他生長因子的影響表現(xiàn)在BMP-2增加大鼠成骨細胞IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ，BMP-4增加單核細胞TGFβ，而BMP-7能增加IGF-Ⅱ型受體的數(shù)量和減少IGFBP-4的產(chǎn)生及增加IGFBP-3、-5的產(chǎn)生。BMPs通過調(diào)節(jié)這些生長因子而誘導(dǎo)成骨作用［9，16，17］。

3.4　白細胞介素1(IL-1)

IL-1由單核巨噬細胞和骨髓基質(zhì)細胞產(chǎn)生，可自分泌、旁分泌發(fā)揮作用?，F(xiàn)已證明，它不僅對破骨細胞性骨吸收有明顯促進作用，而且它還能影響成骨細胞性骨形成。IL-1對成骨細胞增殖有促進作用，而它對成骨細胞分化的作用比較復(fù)雜，不同的研究結(jié)果顯示，IL-1可以刺激或抑制膠原合成、AKP活性和骨鈣素合成。實驗結(jié)果的不同是由于實驗中所采用成骨細胞培養(yǎng)方法、細胞密度、IL-1劑量和IL-1處理時間、方式的不同［2］。最近，Shadman用大鼠骨髓基質(zhì)細胞進行實驗，觀察到IL-1短暫作用于成骨細胞時，骨結(jié)節(jié)形成增加且呈劑量依賴性；而IL-1較長時間作用于成骨細胞時可產(chǎn)生雙向作用，低劑量增加骨結(jié)節(jié)形成，而較高劑量對骨結(jié)節(jié)形成不產(chǎn)生影響或產(chǎn)生抑制作用。不僅如此，IL-1對骨形成的作用也與細胞密度有關(guān)，抑制作用只在采用最高的細胞密度接種時出現(xiàn)。在體實驗研究表明，間斷注射IL-1導(dǎo)致骨吸收的短暫增加，而隨后伴隨較長時間的骨形成增加［2，6，18］。

IL-1的產(chǎn)生受全身激素的調(diào)控，雌激素能抑制成骨細胞分泌IL-1，而1，25(OH)2D3作用于成骨細胞使其產(chǎn)生IL-1增加［19］。

3.5　腫瘤壞死因子α(TNFα)

TNFα是17KDa的細胞因子，由破骨細胞樣細胞及成骨細胞合成?，F(xiàn)已證明TNFα可以直接作用于成骨細胞，對其增殖、分化產(chǎn)生影響。TNFα對成骨細胞的作用較復(fù)雜，TNFα在非轉(zhuǎn)化的成骨細胞系中能刺激DNA合成，而在大鼠骨肉瘤細胞系(ROS17/2.8)培養(yǎng)中，TNFα不影響DNA合成或在低劑量時抑制DNA合成。最近，F(xiàn)rost在人成骨細胞(hOBs)培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，TNFα低劑量時刺激成骨細胞增殖，而在高劑量時抑制增殖?，F(xiàn)在，學者們在TNFα對成骨細胞分化的作用的研究結(jié)果比較統(tǒng)一，均認為TNFα抑制膠原合成、AKP活性和骨鈣素合成［2，19，20］。

TNFα在骨組織中產(chǎn)生的調(diào)控也與IL-1有相似之處。E2可抑制TNFα的產(chǎn)生，而1，25(OH)2D3則促進TNFα基因轉(zhuǎn)錄，增加TNFα形成［19］。這些全身激素常通過調(diào)控骨組織中的細胞因子產(chǎn)生從而調(diào)節(jié)骨形成。

除以上局部因子外，其他因子如表皮生長因子(EGF)、TGFα、血小板源性生長因子(PDGF)及一氧化氮等均對骨形成有明顯作用。