人凝血酶原復(fù)合物分離純化技術(shù)推陳出新

近年來，隨著我國肝炎發(fā)病率的增加，以及臨床醫(yī)師對人凝血酶原復(fù)合物（PCC）制劑治療效果的認同，PCC制劑被大量應(yīng)用于臨床肝臟出血的患者，需求量逐年增加。PCC包括凝血因子II（凝血酶原）、VII（穩(wěn)定因子）、IX（抗乙型血友病因子）、X（自身凝血酶III）?，F(xiàn)有的PCC分離純化方法主要為直接從血漿中用凝膠吸附和低溫乙醇沉析并經(jīng)凝膠吸附，其中直接從血漿中用凝膠吸附的方法又分為經(jīng)典的批式吸附法和半流動吸附法。由于血漿中抑制凝血因子活化的一些天然抑制劑會被乙醇所滅活，從而使凝血因子活化，所以目前大多數(shù)血液制品生產(chǎn)企業(yè)采用直接從血漿或去冷沉淀的血漿中用凝膠吸附的方法制備PCC。但是，PCC制劑中含有部分雜蛋白，尤其是被激活的因子Xa、IXa、VIIa等，臨床輸注偶可誘發(fā)彌散性血管內(nèi)凝血（DIC）和血栓并發(fā)癥。為避免這一問題，需要進一步改進分離純化工藝?？上驳氖牵陙?，隨著現(xiàn)代生物分離純化技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了一些新型單元分離技術(shù)，如親和層析法、逆膠束法、擴張床吸附技術(shù)（EBA）、雙水相分配技術(shù)等，其中最為成功的擴張床吸附技術(shù)已被應(yīng)用于工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)。

批式吸附法：操作麻煩且成本較高

經(jīng)典的批式吸附法經(jīng)荷蘭紅十字會輸血中心Heysteck等人提出，后經(jīng)Brumm-elhuis等人完善后被用于大規(guī)模制備PCC。具體工藝為：血漿（去冷沉淀上清）加DEAE-SephadexA50(1~1.5克干重/升血漿)，在10℃~15℃下攪拌45分鐘；去離心分離出的上清，進一步分離其他血漿蛋白，分離出的凝膠用pH值7.0、含0.01摩爾/升枸櫞酸鈉的0.2摩爾/升的氯化鈉溶液洗滌3次，將洗液廢棄（此過程會造成凝血因子II約20％的損失）；再用pH值7.0、含0.015摩爾/升枸櫞酸鈉的2.0摩爾/升的氯化鈉溶液洗脫兩次；洗脫液經(jīng)SephadexG-25凝膠過濾脫鹽后，加入0.3%磷酸三丁酯和1%吐溫80經(jīng)24℃～26℃、6小時病毒滅活；最后經(jīng)除菌過濾后，分裝、凍干得成品。通常在PCC制備的最后階段前，要加入肝素或肝素與抗凝血酶III，以防止或減少凝血因子活化。但是，該工藝存在明顯的缺點：吸附是在攪拌罐內(nèi)進行，由于凝膠的機械強度不高，所以凝膠的破損率大，生產(chǎn)成本高；PCC經(jīng)批式吸附后，洗滌和洗脫需在柱內(nèi)進行，操作麻煩，易產(chǎn)生交叉污染，血漿處理量受到限制。

半流動法：控制簡單、吸附能力較強

為克服經(jīng)典批式吸附法的缺點，美國紅十字會Holland實驗室的Tharakan等開發(fā)了一種半流動方法，即用離子交換吸附劑從去冷沉淀血漿中制備PCC。該方法采用一個帶攪拌功能的圓柱，而無需手工操作，可增加血漿與凝膠的接觸，減少總的操作時間。

具體工藝為：將DEAE-SephadexA50用0.85摩爾/升的氯化鈉溶液溶脹，淘洗出細小顆粒，加入與凝膠等體積量的0.075摩爾/升的氯化鈉溶液，121℃滅菌30分鐘；將準(zhǔn)備好的850克凝膠灌進圓柱，經(jīng)0.8微米的筒式濾器泵入去冷沉淀的血漿50升；攪拌25分鐘，以2升/分鐘的速度放出血漿；用0.07摩爾/升枸櫞酸鈉的（pH值為6.0）溶液懸浮洗滌60分鐘，洗兩次；然后用0.2摩爾/升枸櫞酸鈉（pH值6.0）溶液洗脫PCC；其余過程同經(jīng)典批式吸附法。

與批式吸附法不同的是，半流動法中血漿與離子交換劑在圓柱體內(nèi)連續(xù)流動混合，未吸附血漿的去除過程包含在吸附過程中，洗滌、洗脫在同一容器內(nèi)，因此過程控制簡單，并較經(jīng)典方法可顯著地改進凝膠吸附凝血因子II和凝血因子IX的能力。研究表明，批式吸附法和半流動法中凝血因子II、凝血因子IX、凝血因子X的活性回收率分別為27.6%和60%，49.1%和68%，51.2%和57.1%，所以半流動法優(yōu)于批式吸附法。

親和層析法：用于制備高純制劑工藝成熟

親和層析法是生產(chǎn)高純凝血因子IX的成熟工藝，法國CRTS公司就采用親和層析法生產(chǎn)凝血因子IX高純制劑。該方法主要是采用肝素－瓊脂糖CL-6B凝膠親和層析，所得凝血因子IX的平均比活達119±10國際單位/毫克，平均得率為320±28國際單位/升血漿。另外，目前也有公司采用鼠源抗-凝血因子IX單克隆抗體純化凝血因子IX，其比活可達204~273國際單位/毫克；也可通過金屬鰲合親和層析純化凝血因子IX，通常是將含凝血因子IX的高鹽溶液加入銅離子鰲合瓊脂凝膠層析柱，用低pH值和低鹽的緩沖液洗脫凝血因子X，隨后用含氨基乙酸的緩沖液將凝血因子IX洗脫出來，所得產(chǎn)品的比活達160國際單位/毫克；若增加親和步驟，如將擬親和層析－親和層析－鰲合層析－羥基磷灰石層析組合，所得產(chǎn)品的比活可達240~300國際單位/毫克。

擴張床吸附技術(shù)：變“竭澤而魚”為“金鉤釣魚”

擴張床吸附（EBA）技術(shù)作為一項新型分離技術(shù)，一改早期的分離過程設(shè)計中往往圍繞雜質(zhì)的去除來進行分離純化的思路，而采用從組分復(fù)雜的料液中直接獲得目標(biāo)產(chǎn)物的設(shè)計思路。相關(guān)研究人員將這種觀念上的改變形象地比喻為由“竭澤而魚”到“金鉤釣魚”。這種觀念上的轉(zhuǎn)變符合現(xiàn)代分離技術(shù)的發(fā)展趨勢。

中科院過程工程研究所的路秀玲等開展了用擴張床吸附高效純化牛血紅蛋白的研究。他們采用STREAMLINESP吸附劑直接從牛血紅細胞破碎液中純化血紅蛋白。所確定的優(yōu)化吸附條件為：吸附過程選用離子強度為10毫摩爾/升的磷酸鹽緩沖系統(tǒng)，進料線速度為198厘米/小時，進料pH值6.6，改變緩沖液pH值為7.2進行洗脫，操作溫度4℃。實驗結(jié)果表明，在該條件下，動態(tài)吸附容量達70~75毫克/毫升，只經(jīng)一步操作產(chǎn)品純度即達電泳純。丹麥的Upfront Chromatography A/S公司也利用EBA技術(shù)直接從人血漿中分離純化出白蛋白、丙種球蛋白、α1－抗胰蛋白酶、纖維蛋白原和凝血因子。EBA技術(shù)適合處理組分復(fù)雜、料液黏度大、洗滌困難的物料。

我國現(xiàn)狀：質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)低于歐洲工藝水平有待提高

關(guān)于PCC的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，《中國藥典》2005年版規(guī)定，PCC中凝血因子IX的效價不低于10國際單位/毫升，且凝血因子IX的比活性不低于0.3國際單位/毫克蛋白質(zhì)。對比《歐洲藥典》2005版的規(guī)定，即PCC中凝血因子IX的效價不低于20國際單位/毫升，且凝血因子IX的比活性不低于0.6國際單位/毫克蛋白質(zhì)，由此可見，我國的PCC質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)低于《歐洲藥典》，這也反映出我國的PCC分離純化工藝有待提高。

目前，國外的研究重點是耦合多種層析分離技術(shù)，制備各種含單一凝血因子，如凝血因子IX、VII、XI等的濃縮制劑。我國的血漿蛋白分離純化主要是低溫乙醇沉淀分離純化技術(shù)，層析分離純化技術(shù)僅在部分小制品的分離中采用。目前，僅有部分廠家采用經(jīng)典吸附法生產(chǎn)，存在處理量小，產(chǎn)量低，因子活性損失大等缺陷。因此，我國PCC分離純化工藝與國外還有較大差距。