蛋白質(zhì)組學(xué)研究的內(nèi)容、方法及意義

生物有機(jī)體的生理活動(dòng)、病理活動(dòng)以及藥物的作用主要是通過蛋白質(zhì)來實(shí)現(xiàn)的，然而僅憑目前已知的蛋白質(zhì)根本無法闡明各種復(fù)雜的生命活動(dòng)過程，因此，以基因組的研究成果為基礎(chǔ)，以各種先進(jìn)技術(shù)為支撐，進(jìn)一步研究生物有機(jī)體的全部蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能及其相互作用已經(jīng)成為必然。目前大量工作者致力于蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，本文現(xiàn)對(duì)此作一簡(jiǎn)述。

1.蛋白質(zhì)組學(xué)的定義及研究?jī)?nèi)容

蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)是研究在特定時(shí)間或環(huán)境下某個(gè)細(xì)胞或某種組織的基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)的真正含義在于：它不是按照傳統(tǒng)的方式孤立地研究某種蛋白質(zhì)分子的功能，而是應(yīng)用各種蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究某種蛋白質(zhì)在復(fù)雜的細(xì)胞環(huán)境中的功能。蛋白質(zhì)組學(xué)旨在列出全部蛋白質(zhì)的細(xì)目，弄清每一個(gè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能及蛋白質(zhì)群體內(nèi)的相互作用，對(duì)比在疾病和健康狀態(tài)下它們的表達(dá)水平的變化。

蛋白質(zhì)組學(xué)分為表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)和細(xì)胞圖譜蛋白質(zhì)組學(xué)。前者利用各種先進(jìn)技術(shù)研究蛋白質(zhì)表達(dá)的整體變化，即研究在機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育、疾病和死亡的不同階段中，細(xì)胞與組織的蛋白質(zhì)組分的變化；后者主要通過分離蛋白質(zhì)復(fù)合物系統(tǒng)地研究蛋白質(zhì)間的相互作用。

2.蛋白質(zhì)組與基因組的關(guān)系

基因是遺傳信息的攜帶者，蛋白質(zhì)則是生命活動(dòng)的執(zhí)行者。實(shí)際上每一種生命運(yùn)動(dòng)形式，都是特定蛋白質(zhì)群體在不同時(shí)間和空間出現(xiàn)并發(fā)揮功能的結(jié)果。因而蛋白質(zhì)組研究是我們理解細(xì)胞功能和疾病發(fā)生發(fā)展過程的中心環(huán)節(jié)。如果不能共同致力于蛋白質(zhì)組的研究，那么基因組的研究成果將無法兌現(xiàn)。

ＤＮＡ序列所提供的信息僅僅是一種靜止的資源，而細(xì)胞的生命活動(dòng)是通過各種蛋白質(zhì)來實(shí)現(xiàn)的一種動(dòng)態(tài)過程。一個(gè)機(jī)體內(nèi)所有不同的細(xì)胞都共享同一基因組，然而同一個(gè)機(jī)體的不同細(xì)胞和不同組織卻有不同的蛋白質(zhì)組，而且機(jī)體在不同發(fā)育階段，直至最后消亡的全過程中蛋白質(zhì)組也在不斷變化。因而蛋白質(zhì)組要比基因組復(fù)雜得多。由于對(duì)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的選擇性剪切、翻譯起止點(diǎn)的變化或者ｍＲＮＡ上三聯(lián)體密碼發(fā)生移碼突變等均可以明顯促進(jìn)蛋白質(zhì)多樣性的產(chǎn)生，而且ｍＲＮＡ的水平并不能反映蛋白質(zhì)水平，即使一個(gè)開放閱讀框(ＯＲＦ)呈現(xiàn)在面前，也根本無法證實(shí)某種蛋白質(zhì)存在與否。此外，蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的位置、穩(wěn)定性的變化，以及與不同的物質(zhì)如其它蛋白質(zhì)、核酸、脂類等配基相結(jié)合，再加上蛋白質(zhì)具有多種修飾形式，如糖基化、磷酸化、乙酰化、硫酸化、連接在各種載體上，如小的泛素蛋白等，所有這些均可導(dǎo)致蛋白質(zhì)組要比基因組復(fù)雜多個(gè)數(shù)量級(jí)，同時(shí)也說明基因的存在和多樣性與蛋白質(zhì)的存在和多樣性之間是不均衡的。因此，利用基因組的研究成果進(jìn)行大規(guī)模的蛋白質(zhì)組研究已經(jīng)成為必然。

人類基因組測(cè)序成功為蛋白組研究奠定了良好基礎(chǔ)。例如，金黃色葡萄球菌病原體的全套基因組測(cè)序已經(jīng)完成，通過基因組的信息來研究其蛋白質(zhì)組成將有助于發(fā)現(xiàn)新的抗癌因子、抗生素、工業(yè)催化劑等；1995年流感嗜血桿菌全部基因組測(cè)序完成，為支氣管感染的研究提供了蛋白質(zhì)組學(xué)基礎(chǔ)，這些工作將會(huì)是蛋白質(zhì)組學(xué)的重要組成部分。

3.蛋白質(zhì)組的研究方法

蛋白質(zhì)組研究需要有足夠的技術(shù)支撐，如質(zhì)譜分析(ＭＳ)，酵母雙雜交系統(tǒng)，蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)以及能夠進(jìn)行大規(guī)模數(shù)據(jù)處理的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)和軟件等[6]。現(xiàn)階段蛋白質(zhì)組的研究可分為3個(gè)主要步驟：應(yīng)用雙向凝膠電泳、“雙向”高效柱層析分離蛋白質(zhì)；應(yīng)用氨基酸組成分析、Ｃ或Ｎ末端氨基酸序列分析及質(zhì)譜分析鑒定所分離的蛋白質(zhì)；應(yīng)用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)鑒定結(jié)果進(jìn)行存儲(chǔ)、處理、對(duì)比和分析。

3.1　雙向凝膠電泳　雙向凝膠電泳(two-dimensionalpolycacrylamidegelelectrophoresis，2-D電泳)是分離蛋白質(zhì)最基本的工具。其原理是：第一向是等電聚集電泳：用ｐＨ值呈梯度排列的凝膠，分離等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)。第二向是十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPEGE)：由于帶負(fù)電荷的SDS可與蛋白質(zhì)多肽鏈結(jié)合，掩蓋了蛋白質(zhì)原有的電荷差別，故可分離分子量不同的蛋白質(zhì)。

雙向凝膠電泳不僅用于蛋白質(zhì)的分離，同時(shí)也用于蛋白質(zhì)的純化，一張凝膠可分離純化出幾千個(gè)甚至上萬個(gè)蛋白質(zhì)。目前美國(guó)的Proteome公司已開發(fā)了一種全自動(dòng)化的儀器，灌腔、電泳、染色全部實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。

雙向凝膠電泳技術(shù)存在的問題是不易分離極酸或極堿、極大(>200kD)或極小(<10kD)的蛋白質(zhì)，不易檢測(cè)低拷貝(<1000拷貝)蛋白質(zhì)或難溶解蛋白質(zhì)。此外，還有三種新的方法可以用作對(duì)2Ｄ電泳的補(bǔ)充：帶有同位素的親和性標(biāo)簽標(biāo)記法，二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)量

法，毛細(xì)管區(qū)帶電泳。

3.2　“雙向”高效柱層析　“雙向”高效柱層析原理：第一向用分子篩柱層析，按蛋白質(zhì)不同分子量進(jìn)行分離；第二向用反向柱層析，利用蛋白質(zhì)表面疏水性質(zhì)進(jìn)行分離。第二向的分離原理與雙向凝膠電泳中利用蛋白質(zhì)等電點(diǎn)分離完全不同，因此兩種方法可相互補(bǔ)充。

雙向高效柱層析的優(yōu)點(diǎn)：(1)可分離得到較多的蛋白量以供鑒定；(2)可與質(zhì)譜分析聯(lián)用，分離流出的蛋白峰直接進(jìn)入質(zhì)譜儀進(jìn)行鑒定。

3.3　氨基酸組成分析　氨基酸組成分析可提供蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)信息。原理是用酸水解蛋白質(zhì)，測(cè)定蛋白質(zhì)中各氨基酸所占摩爾百分?jǐn)?shù)(%)或各氨基酸的摩爾比率，與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知蛋白質(zhì)的理論值進(jìn)行比較。氨基酸組成分析經(jīng)濟(jì)、快速，但靈敏度低。

3.4　Ｃ-或Ｎ-端氨基酸序列分析?。?端氨基酸序列分析常用Edman降解法測(cè)定蛋白質(zhì)Ｎ端氨基酸序列，Ｃ端氨基酸序列分析常用羧肽酶法、化學(xué)降解法測(cè)定蛋白質(zhì)Ｃ端氨基酸序列。目前均可用自動(dòng)測(cè)序儀。

Ｎ-端4個(gè)氨基酸殘基序列即可鑒定43%～83%蛋白質(zhì)、Ｃ-端5個(gè)氨基酸殘基序列即可鑒定74%～97%蛋白質(zhì)，若兩者結(jié)合使用，判斷結(jié)果的準(zhǔn)確性會(huì)更高。

3.5　質(zhì)譜分析　以往ＭＳ僅用于小分子揮發(fā)物質(zhì)的分析，由于新的離子化技術(shù)的出現(xiàn)，如：介質(zhì)輔助的激光解析/離子化、電噴霧離子化，各種新的質(zhì)譜技術(shù)開始用于生物大分子的分析。其原理是：通過電離源將蛋白質(zhì)分子轉(zhuǎn)化為氣相離子，然后利用質(zhì)譜分析儀的電場(chǎng)、磁場(chǎng)將具有特定質(zhì)量與電荷比值(Ｍ/Ｚ值)的蛋白質(zhì)離子分離開來，經(jīng)過離子檢測(cè)器收集分離的離子，確定離子的Ｍ/Ｚ值，分析鑒定未知蛋白質(zhì)。

質(zhì)譜技術(shù)主要用于檢測(cè)雙向凝膠電泳或“雙向”高效柱層析分離所得的蛋白質(zhì)及酶解所得的多肽的質(zhì)量，也可用于蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)間相互作用等方面的研究。三條肽段的精確質(zhì)量數(shù)便可鑒定蛋白質(zhì)。

近年來，串聯(lián)質(zhì)譜分析儀發(fā)展迅猛，其數(shù)據(jù)采集方面的自動(dòng)化程度、檢測(cè)的敏感性及效率都大大提高，大規(guī)模數(shù)據(jù)庫(kù)和一些分析軟件(如：SEQUEST)的應(yīng)用使得串聯(lián)質(zhì)譜分析儀可以進(jìn)行更大規(guī)模的測(cè)序工作。目前，利用2Ｄ電泳及ＭＳ技術(shù)對(duì)整個(gè)酵母細(xì)胞裂解產(chǎn)物進(jìn)行分析，已經(jīng)鑒定出1484種蛋白質(zhì)，包括完整的膜蛋白和低豐度的蛋白質(zhì)。

3.6　酵母雙雜交系統(tǒng)　對(duì)于研究蛋白質(zhì)間的相互作用，酵母雙雜交系統(tǒng)是非常有力的工具。其基本原理是：由于所有真核生物轉(zhuǎn)錄激活因子都由兩部分獨(dú)立的功能域組成，即ＤＮＡ結(jié)合功能域(ＤＮＡＢＤ)和激活功能域(ＡＤ)。ＤＮＡＢＤ的作用是與特異的啟動(dòng)子結(jié)合，ＡＤ的作用是引導(dǎo)ＲＮＡ聚合酶Ⅱ復(fù)合物，兩者靠近并協(xié)同作用，才能使ＤＮＡ結(jié)合位點(diǎn)下游的基因得以轉(zhuǎn)錄。如果將待測(cè)蛋白之一與ＤＮＡＢＤ融合，蛋白之二與ＡＤ融合，若待測(cè)的兩種蛋白有相互作用，則ＤＮＡＢＤ和ＡＤ靠近并激活報(bào)道基因的轉(zhuǎn)錄，借此可研究蛋白質(zhì)間的相互作用。

為了大規(guī)模高通量研究蛋白間的相互作用，近年來發(fā)展了一種酵母雙雜交掃描法。首先建立兩類含不同ｃＤＮＡ文庫(kù)的酵母菌株，在第一類菌株中，讀碼框(ＯＲＦ)以ＤＮＡＢＤ融合蛋白形成被表達(dá)，在第二類菌株中，ＯＲＦ以ＡＤ融合蛋白形式被表達(dá)，將兩類菌株配對(duì)，用缺陷的培養(yǎng)基篩選二倍體，只有表達(dá)兩種可以相互作用的蛋白質(zhì)的酵母細(xì)胞才可以在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。

該方法的應(yīng)用模式有兩種：一種是微陣列模式，即先將第一類酵母菌(表達(dá)已知蛋白-ＤＮＡＢＤ融合蛋白)克隆在陣列的柵狀網(wǎng)孔內(nèi)，以此篩查第二類菌株(表達(dá)待測(cè)蛋白ＡＤ融合蛋白)，從而確定待測(cè)蛋白質(zhì)可與哪一已知蛋白質(zhì)相結(jié)合；另一種是庫(kù)篩查模式，即先將一組ＯＲＦ產(chǎn)生的融合蛋白建成一個(gè)庫(kù)，而后通過待測(cè)蛋白質(zhì)與庫(kù)中的蛋白質(zhì)的反應(yīng)尋找可以相互作用某個(gè)或某些蛋白質(zhì)。

最近，從酵母雙雜交系統(tǒng)衍生出一種新的方法，稱為“反向雙雜交”，主要用于鑒定可以干擾蛋白質(zhì)間相互作用的化合物和多肽。與傳統(tǒng)方式不同，這種方法可以用于開發(fā)在體內(nèi)具有活性的藥物。此外，酵母雙雜交系統(tǒng)的作用已經(jīng)擴(kuò)展至對(duì)蛋白質(zhì)的鑒定，通過這種方法已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與酵母菌ｍＲＮＡ剪接相關(guān)的15種蛋白質(zhì)，以及噬菌體Ｔ7的55種蛋白質(zhì)、痘苗病毒的226種蛋白質(zhì)、釀酒酵母的5345種蛋白質(zhì)。酵母雙雜交系統(tǒng)提供的蛋白質(zhì)間可能的相互作用的信息，還需通過進(jìn)一步的生物化學(xué)試驗(yàn)加以確定和排除。

3.7　微陣列技術(shù)　嚴(yán)格的講，ＤＮＡ微陣列技術(shù)并非蛋白質(zhì)組技術(shù)的范疇，但是卻不失為大規(guī)模研究蛋白質(zhì)功能的一種好方法。通常在轉(zhuǎn)錄中受到協(xié)同調(diào)控的基因?qū)⒕幋a同種功能的蛋白質(zhì)，如果某一段ＤＮＡ序列與已知功能的ＤＮＡ序列在很大程度上相同，說明它們編碼的蛋白質(zhì)的功能也可能相同，例如酵母細(xì)胞中與細(xì)胞分裂周期和芽孢形成相關(guān)的基因可能編碼功能相同的蛋白質(zhì)。

蛋白質(zhì)陣列技術(shù)已經(jīng)發(fā)展起來，蛋白質(zhì)樣品以納升小滴共價(jià)吸附在玻璃、硅、塑料等載物片上，每一個(gè)載物片可以點(diǎn)10000個(gè)樣品，可用于鑒定一個(gè)生物有機(jī)體的全部修飾酶。例如：蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)已經(jīng)檢測(cè)出酵母中近乎全套的蛋白激酶。

3.8　生物信息學(xué)　蛋白質(zhì)組的研究要求有自動(dòng)化處理大規(guī)模數(shù)據(jù)的工具，從而促使生物信息學(xué)迅速發(fā)展。目前許多與蛋白質(zhì)組相關(guān)的軟件可通過與EXPASY蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)器鏈接而獲得(ｗｗｗ.ｅｘｐａｓｙ.ｃｈ/ｗｗｗ/ｔｏｏｌｓ.ｈｔｍｌ)，這些軟件可用于鑒定蛋白質(zhì)的種類，分析蛋白質(zhì)的理化特性，預(yù)測(cè)可能的翻譯后修飾以及蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，其中注釋蛋白質(zhì)和二維凝膠電泳數(shù)據(jù)庫(kù)是蛋白質(zhì)組研究的生物信息學(xué)核心。

4.蛋白質(zhì)組學(xué)與疾病

蛋白質(zhì)組學(xué)可以讓我們對(duì)人類疾病的發(fā)病機(jī)制有更加清楚的認(rèn)識(shí)。在基因水平檢測(cè)基因的突變和多態(tài)性，在蛋白質(zhì)水平分析健康及病變組織不同水平的基因表達(dá)，對(duì)于疾病的發(fā)病機(jī)制的研究二者均具有重要意義，但對(duì)于疾病的診斷治療方面后者更為重要。正常及患病個(gè)體的組織、體液中的蛋白質(zhì)分布、特征及差異都是將蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于分子診斷學(xué)的基礎(chǔ)。例如：骨髓瘤患者尿液中沉淀物??BenceJones蛋白、抗上皮細(xì)胞腫瘤特異性抗體、病變肝細(xì)胞中的ｐ53蛋白均可以作為腫瘤的標(biāo)記，用于腫瘤的診斷。目前，應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已發(fā)現(xiàn)許多與癌癥相關(guān)的異常糖基化的蛋白質(zhì)，但將這些研究結(jié)果應(yīng)用于臨床診斷其價(jià)值尚待評(píng)估。

到目前為止，心功能障礙的發(fā)病機(jī)制仍未闡明。如果用蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法分析心肌蛋白質(zhì)表達(dá)的變化，將為闡明心臟疾病相關(guān)的細(xì)胞病變機(jī)制提供新的思路，也將有助于發(fā)現(xiàn)新的診斷標(biāo)記、治療方法。人類心臟蛋白質(zhì)聯(lián)合二維電泳數(shù)據(jù)庫(kù)(ｗｗｗ.ｅｘｐａｓｙ.ｃｈ/ｃｈｚｄ/ｚｄｉｎｄｅｘ.ｈｔｍｌ)已建立，目前已鑒定幾百種心臟蛋白質(zhì)。

對(duì)于感染性疾病而言，由于許多微生物的部分或全部基因組的測(cè)序工作已經(jīng)完成，這將有助于鑒定該微生物所產(chǎn)生的全部蛋白質(zhì)，以尋找新的診斷標(biāo)記，尋找用作疫苗的抗原及毒力決定簇等。

5.蛋白質(zhì)組與藥物開發(fā)

藥物作用的靶標(biāo)多為蛋白質(zhì)。如何發(fā)現(xiàn)更多的藥物作用的靶蛋白是藥品開發(fā)面臨的主要挑戰(zhàn)。蛋白質(zhì)組研究能發(fā)現(xiàn)那些在健康人組織細(xì)胞中正常表達(dá)或不存在，而在患者組織細(xì)胞中異常表達(dá)或出現(xiàn)的蛋白質(zhì)，為藥品開發(fā)提供新的藥物靶標(biāo)，或新的生物標(biāo)記，還能發(fā)現(xiàn)與藥物毒性相關(guān)的蛋白質(zhì)，用于預(yù)報(bào)藥物的毒副作用，從而減少到臨床試驗(yàn)階段才發(fā)現(xiàn)該藥物的副作用所造成的中間階段的損耗。

除了藥物作用的靶蛋白的選擇外，觀察藥物對(duì)靶蛋白的作用及藥物毒性的研究也同樣重要。在這一研究領(lǐng)域中，可采用CD-標(biāo)記(CD-tagging)技術(shù)研究用藥期間蛋白質(zhì)組中的任一成員在分子和細(xì)胞水平的各種變化。其原理是將帶有CD-tagging的CD盒插入某一個(gè)表達(dá)基因的內(nèi)含子，結(jié)果該基因轉(zhuǎn)錄的ｍＲＮＡ增加了一段外來序列，該基因編碼的蛋白質(zhì)增加了一個(gè)特殊的外來肽???抗原決定簇或熒光蛋白，這種外來肽作為標(biāo)記物，可用高效價(jià)的抗體識(shí)別或各種熒光檢測(cè)方法觀察，標(biāo)記的基因及轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的變化可用多聚酶鏈反應(yīng)(ＰＣＲ)、逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(ＲＴＰＣＲ)、測(cè)序等方法觀察。因此，ＣＤ標(biāo)記技術(shù)可用來研究基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯水平的變化，評(píng)估基因的功能狀態(tài)，探查蛋白質(zhì)表達(dá)的組織特異性，以及蛋白質(zhì)在細(xì)胞或細(xì)胞器中的定位，等等。該項(xiàng)技術(shù)的特點(diǎn)是：(1)尤其適用于標(biāo)記內(nèi)含子豐富的基因；(2)被標(biāo)記的基因、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及蛋白質(zhì)均保留正常的功能；(3)不影響基因的正常調(diào)控；(4)可在組織細(xì)胞原位觀察研究標(biāo)記基因、標(biāo)記蛋白；(5)也可從組織細(xì)胞中分離提純標(biāo)記蛋白，然后用于生化、功能檢查。

蛋白質(zhì)組學(xué)正日漸走向成熟。相信對(duì)于未來醫(yī)學(xué)的發(fā)展，無論是基礎(chǔ)、臨床研究，還是藥物開發(fā)，蛋白質(zhì)組學(xué)的貢獻(xiàn)都將不可估量。