中藥材真?zhèn)舞b別新方法——DNA分子標記鑒別技術(shù)

中藥品種繁多，應(yīng)用歷史悠久，產(chǎn)區(qū)廣泛。由于地理和歷史的原因，藥材品種混亂，基源復(fù)雜，如僅《中華人民共和國藥典》2000年版收載的534種中藥材，即有143種為多基源(二基源以上)，占收載總數(shù)的27%。加之中藥的同名異物或同物異名現(xiàn)象普遍存在以及偽品、混淆品和誤用品等因素，對中藥的化學(xué)成分和藥理作用的研究、制劑生產(chǎn)、臨床療效及推廣使用等都有直接影響，嚴重影響了中醫(yī)藥的信譽。同時，即使是同種藥材，由于產(chǎn)地不同、野生與栽培以及生長年限不同都表現(xiàn)出質(zhì)量和療效上的差異，些問題為中藥材鑒別方法提出了新的挑戰(zhàn)，依賴經(jīng)典形態(tài)分類以及傳統(tǒng)鑒別方法已無法滿足鑒別的需要。隨著各種先進儀器以及分子生物學(xué)的發(fā)展，各種新的鑒別方法亦紛紛推出，如紅外光譜鑒別、化學(xué)指紋圖譜鑒別以及DNA分子標記鑒別等，中藥材鑒別領(lǐng)域顯示出了蓬勃的生機。

近年來，以PCR為基礎(chǔ)的DNA分子標記鑒別技術(shù)在中藥材真?zhèn)舞b別中發(fā)揮了重要的作用，同時，在多基源品種的鑒別及道地藥材鑒別中也嶄露頭角，顯示出了巨大的前景。以人參、西洋參的分子標記鑒別研究為例，可以清楚地看出中藥材分子標記鑒別的研究軌跡。從1994年AP-PCR首次用于人參、西洋參的鑒別以來，已有24篇相關(guān)的報道，按照所用方法的不同可三種：①基于PCR技術(shù)的方法有18篇文獻，其中利用隨機引物如RAPD和Ap-PCR等的有9篇，利用特異引物如MARMS、SCAR等的3篇，AFLP的3篇，PCR-RFLP的3篇；②利用DNA測序技術(shù)的有7篇；③基于分子雜交的方法有1篇，主要針對重復(fù)序列。有的報道中同時使用兩種方法，如同時使用ITS序列分析與RAPD、PCR—RFLP和RAPD等。根據(jù)各文獻發(fā)表時間及其使用的方法可以得到人參類藥材分子鑒定的發(fā)展特點：①隨機引物雖占據(jù)主導(dǎo)地位，但隨著時間的推移，RAPD等方法逐漸推出舞臺。無須預(yù)先知道基因組信息的特點，使RAPD在中藥材分子鑒定上成為最主要的方法，但隨著18S、matK基因的測序，新方法便得以誕生，如MARMS。同時，在RAPD基礎(chǔ)上發(fā)展起來的方法也顯示了極好的應(yīng)用前景，如SCAR標記以及應(yīng)用梯度PCR檢測中藥復(fù)方中人參的PCR引物均是從RAPD的特異條帶中得到的。②序列分析是各種新方法應(yīng)用的基礎(chǔ)。植物核基因組中的rDNA是研究最為廣泛的基因之一，其中18S、ITS以及5S已成功的應(yīng)用與人參西洋參的鑒別，可以直接利用測序后的堿基變異作為鑒別指標也可以利用等位基因PCR直接檢測變異位點，從而通過電泳就可達到準確的鑒別。等位基因PCR簡單、快捷、目標明確，有非常大的推廣應(yīng)用價值。此外，葉綠體基因中的編碼間隔區(qū)正逐漸成為分子系統(tǒng)學(xué)研究的熱點，如參類藥材對葉綠體基因中的matK以及trnC-trnD進行了測序。③簡單、快捷、準確是分子鑒定發(fā)展的趨勢。參類藥材分子鑒定的歷程基本是隨機引物—序列分析—PCR-RFLP—AFLP—特異引物PCR，體現(xiàn)了由復(fù)雜向簡單的過程。近兩年來，特異引物的應(yīng)用以及在復(fù)方中參類藥材的成功檢出，標志著參類藥材的鑒定達到了十分完美的地步。但這些僅僅解決了藥材的“真?zhèn)巍眴栴}，質(zhì)量的“優(yōu)劣”卻仍然沒有很好的方法，如山參與栽培人參、朝鮮人參與中國人參、美國西洋參與中國引種栽培西洋參的鑒別為我們提出了新的課題。

針對以上問題，可以在以下幾方面加強研究，以期達到“真?zhèn)蝺?yōu)劣”鑒別的最終目標。

一、尋找進化速率快、種間高度變異的DNA序列進行測序分析。如葉綠體基因間隔區(qū)trnD-trnT，rpoB-trnC、trnH-psbA等。品種特征DNA序列的獲得是將其轉(zhuǎn)化為簡易、高效的PCR鑒別以及高通量芯片鑒別的基礎(chǔ)，同時大量序列的獲得，也為中藥材比較基因組學(xué)的研究提供了可能和基礎(chǔ)。

二、大力開發(fā)新型實用的中藥材分子標記鑒別方法和試劑盒。中藥材DNA降解嚴重，合適的DNA提取和鑒別方法的選擇是保證中藥材分子標記鑒別成功的基礎(chǔ)。因此，對已有的各種新型技術(shù)和方法，要進行篩選和改進以適于中藥材鑒別的需要。

三、積極與其他技術(shù)和方法聯(lián)用。不同的方法均存在一定的適用范圍和局限性，如由于DNA分子標記不受生物體發(fā)育階段的影響，無法鑒別不同生長年限的藥材，對同基源（基因型）的野生與栽培藥材的鑒別也存在一定困難，單一的DNA分子標記鑒別無法解決中藥材鑒別的所有難題。因此，積極尋找與各種新型方法技術(shù)的有機聯(lián)用，將可能為中藥材鑒別提供嶄新的空間。如飛速發(fā)展的代謝組學(xué)研究為中藥材代謝標識物鑒別提供了可能，高通量、高靈敏度的GC-TofMS和QTofMS等儀器能同時觀察上千個化合物，監(jiān)測接近全景代謝物的變化，該方法不僅能觀測到主要活性化合物，還能檢測到代謝中間產(chǎn)物（包括非活性物質(zhì)）的變化，不僅能反映植物基因型的差異，也能反映環(huán)境因素的作用。整合DNA分子標記與代謝標識物的“雙標記”方法，將有利于建立與藥材品質(zhì)緊密連鎖的特異、高效的標記平臺，為中藥材鑒別和質(zhì)量控制提供新的方法和技術(shù)。